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芽變主要是芽分生組織細胞中的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，是自然界一種較為常見(jiàn)的現象，較多果樹(shù)品種是基于芽變選育出來(lái)的。其中，作為世界上最古老、最有經(jīng)濟價(jià)值的樹(shù)種之一的葡萄(VitisL.)，一些優(yōu)良栽培品種就源于芽變選育，如巨峰、玫瑰香、夏黑的一些芽變品種，已在生產(chǎn)中推廣、種植。隨著(zhù)高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們在對芽變品種進(jìn)行利用的同時(shí)，深入研究了芽變的分子機制，以期了解芽變發(fā)生的規律。筆者在本文中將歸納引起葡萄芽變的原因及鑒定方法，分析芽變性狀變異機制，為今后的葡萄芽變育種等工作提供參考。

DNA序列的改變造成體細胞突變，從而引起原有植株發(fā)生變異，進(jìn)而形成芽變。目前通過(guò)體細胞突變形成的芽變品種較多。體細胞突變通常發(fā)生在頂端分生組織的一些細胞中，導致嵌合體的發(fā)生。在葡萄中，頂端分生組織主要由兩個(gè)細胞層(L1、L2)組成。L1層主要調控表皮等其他外部組織，L2層參與內部組織的調控。組織發(fā)生層理論顯示，突變時(shí)間不同導致不同嵌合體的形成。周緣嵌合體的形成主要是由于突變時(shí)間發(fā)生時(shí)間較早并且處于某個(gè)組織的中間位置;而扇形嵌合體的出現主要是由于突變較晚且不處于中間位置。

與其他果樹(shù)不同的是，葡萄芽變主要是在周緣嵌合體兩層細胞層間存在遺傳差異。體細胞突變一般會(huì )對植株的單一性狀造成改變，并不會(huì )引起整株植物的多個(gè)性狀發(fā)生改變，它們只改變單層細胞，致使出現周緣嵌合現象，但這種現象并不會(huì )改變整個(gè)植株的多個(gè)性狀，且在整個(gè)生長(cháng)期間都比較穩定。此外，嵌合體中的細胞重新排列組合會(huì )引起整株植物基因型勻化。

周緣嵌合體可能會(huì )導致同一個(gè)基因座上出現兩個(gè)及兩個(gè)以上的等位基因。Franks等使用PinotMeunier及其芽變材料對體細胞突變進(jìn)行研究，將體細胞胚胎中的兩層細胞分離開(kāi)，不同細胞層具有特異的DNA圖譜，表明了不同細胞層間存在遺傳差異。葡萄的嵌合機制不僅能修飾基因型，還能影響葡萄的改良。Hocquigny等研究發(fā)現，黑比諾(Pi-not)無(wú)性繁殖體產(chǎn)生遺傳多樣性的主要原因是第三個(gè)等位基因出現在本應有兩個(gè)雜合位點(diǎn)的位置。對霞多麗芽變研究發(fā)現其表型變異不是由兩個(gè)不同的細胞層L1和L2之間相互作用引起的;通過(guò)SNV基因分型法證明Nebbiolo芽變的基因型不同于母本，芽變的基因型主要是由于L1層的改變。體細胞突變作為芽變產(chǎn)生的最主要原因，其L1層及L2層變異引起芽變的機制仍需深入研究。

二、葡萄芽變的鑒定

2.1形態(tài)學(xué)鑒定

芽變的遺傳類(lèi)別改變主要由染色體結構變異、基因突變、核外突變和染色體數目引起。芽變后葡萄植株多種性狀都會(huì )發(fā)生變異，如成熟期變異、果型變異、果實(shí)及顏色變異、果實(shí)無(wú)核變異。但通過(guò)比對親本及芽變的萌芽期、新梢顏色、葉片大小、果實(shí)顏色、果實(shí)成熟期、新梢節腹側間顏色等性狀可對芽變進(jìn)行迅速辨別。在目前發(fā)現的芽變品種中，變異的性狀可以分為成熟期變異、果型變異、果實(shí)及顏色變異、無(wú)核變異等。

形態(tài)學(xué)性狀的完善為芽變鑒定提供了可靠的依據，但表型的改變往往是基因與環(huán)境共同作用的結果。形態(tài)特征的改變易受外界條件的影響，會(huì )使鑒定結果出現偏差。

2.2孢粉學(xué)鑒定

植物花粉是由花器官發(fā)育而成的，具有高度的保守性和穩定性。因此可以通過(guò)花粉形態(tài)、大小、花粉粒極軸長(cháng)/赤道軸長(cháng)等對花粉進(jìn)行鑒定。目前，在孢粉學(xué)的研究中主要突出孢粉的形態(tài)類(lèi)型、孢粉的大小、孢粉的外壁紋飾，以及孢粉壁的內部結構。李學(xué)強等對巨峰及其芽變98-2的孢粉進(jìn)行分析，發(fā)現其主要差異在花粉大小、形態(tài)及花粉粒極軸長(cháng)/赤道軸長(cháng)。但傳統的孢粉學(xué)鑒定僅通過(guò)花粉粒的形態(tài)特征而不關(guān)注花粉的內部結構特征，導致鑒定結果不夠全面。

2.3同工酶鑒定

同工酶是高等植物中普遍存在的蛋白質(zhì)分子，具有不同的結構和相同的催化作用。其基于不同蛋白質(zhì)形成不同的蛋白質(zhì)區帶譜進(jìn)行鑒定。目前常用于同工酶鑒定的酶類(lèi)主要有過(guò)氧化氫酶、酯酶以及過(guò)氧化物酶。李學(xué)強等使用POD同工酶對巨峰及其芽變98-2分析發(fā)現酶譜存在差異，表明巨峰及其芽變98-2間存在差異。由于每種同工酶代表基因數量有限，并不能全面反映遺傳差異，故可作為輔助鑒定方法。

2.4分子標記鑒定

分子標記(molecularmarker)主要應用于植物性狀及基因型變異的檢測。芽變產(chǎn)生的本質(zhì)主要是遺傳物質(zhì)的變化，因此可以利用染色體和DNA分子水平的方式，來(lái)避免形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)和同工酶鑒定等方法的缺點(diǎn)，達到鑒定芽變的目的。DNA分子標記是通過(guò)一定的方法或技術(shù)手段，在DNA分子水平上揭示個(gè)體或群體間DNA片段差異的一種遺傳標記，在對芽變品種的鑒定中，已開(kāi)發(fā)出多種DNA分子標記并應用于鑒定中。

王西平等對早熟芽變品種早生高墨及其親本高墨進(jìn)行鑒定，發(fā)現引物OPG06及OPW02能有效區分開(kāi)高墨及早生高墨，張國海應用RAPD分子標記能有效鑒定出巨峰和京亞的芽變品種。然而在使用RAPD分子標記技術(shù)對芽變品種進(jìn)行鑒定時(shí)，由于大部分引物標記為顯性標記，并不適用于對多數芽變品種進(jìn)行鑒定。

石艷艷利用iPBS(Inter-PrimerBindingSite)技術(shù)分別對峰早和巨峰、洛浦早生和京亞進(jìn)行區分鑒定，峰早和巨峰之間有12個(gè)iPBS引物均表現出不同的差異條帶，洛浦早生和京亞之間有9個(gè)iPBS引物表現出不同程度的差異性。李琳從50條ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat)引物篩選出29條ISSR引物及7對引物組合，同時(shí)使用引物BC825

能區分巨峰及其芽變品種峰早。Guo等利用SRAP(SequenceRelatedAmplifiedPolymorphism)分子標記方法對鮮食品種中的3個(gè)芽變品種進(jìn)行鑒定。DNA分子標記是區分芽變的一個(gè)重要手段，但是目前仍然沒(méi)有篩選出一些特定引物用來(lái)區分芽變品種。

三、葡萄芽變性狀變異機制

3.1果實(shí)顏色變異

果實(shí)顏色變異主要與花色苷和花青素的積累有關(guān)，同時(shí)果實(shí)顏色的變化也有助于人們對品種的區分。自從葡萄馴化以來(lái)，人們就用果實(shí)顏色的不同來(lái)區分品種。葡萄果實(shí)的顏色是由花色苷在果皮和果肉中的積累引起的。而花色苷是由苯丙烷合成途徑和類(lèi)黃酮生物合成途徑完成的。Carrier等通過(guò)對黑比諾及其3個(gè)克隆體的全基因組序列比較發(fā)現，平均每Mb分別有1.6個(gè)和5.1個(gè)SNP缺失。Vezzulli等對黑比諾的5個(gè)核心SNP位點(diǎn)進(jìn)行測序分析，結果表明這5個(gè)SNP區域具有一種特異性的遺傳結構，在黑比諾、灰比諾、白比諾中總有一個(gè)等位基因的表達量偏低。

Kobayashi等對白皮及紅皮葡萄研究發(fā)現，UFGT基因調控白皮和紅皮葡萄果實(shí)中花青素的合成，紅皮葡萄中的UFGT基因表達量高于白皮葡萄果實(shí)，但其編碼序列和啟動(dòng)子無(wú)任何差別，表明葡萄果皮由白變紅主要是調控UFGT基因的上下游基因突變引起的。同時(shí)結果表明VvmybA1作為主要的調控基因，在類(lèi)黃酮糖基轉移酶UFGT基因的表達中起著(zhù)重要作用，并影響花青素的合成。研究表明白色葡萄品種的出現主要是由于反轉錄轉座子Gret1插入到VvmybA1基因的啟動(dòng)子區域中;而紅色突變主要是由于反轉錄轉座子Gret1未插入到VvmybA1基因中。反轉錄轉座子Gret1是否插入到VvmybA1基因是調控果皮顏色的關(guān)鍵，其主要是通過(guò)抑制花青素生物合成基因的表達，從而產(chǎn)生葡萄果色芽變。

在人們開(kāi)始關(guān)注葡萄顏色變異時(shí)，主要研究變異中花青素含量的變化，目前更多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注基因是如何參與到花青素的生物合成中，并對調控通路、遺傳機制及分子機制進(jìn)行深入研究。

3.2葡萄花序和果穗變異

葡萄果穗主要由葡萄果粒組成，花序及果實(shí)的大小、坐果率的高低影響果穗的形狀和大小。在種植和生產(chǎn)上，釀酒葡萄的果穗小且緊湊，鮮食葡萄的果穗大且稀疏。這主要是由于在葡萄的馴化和篩選過(guò)程中，基因的表達模式及表達量不同從而導致葡萄花序及果穗變異的產(chǎn)生。

在對果穗變異及其親本研究中發(fā)現，赤霉素的負調節基因VvGAI1參與調控果穗的大小，同時(shí)對VvGAI1基因進(jìn)行序列多態(tài)性分析時(shí)發(fā)現單個(gè)基因對葡萄穗質(zhì)量、出汁率、風(fēng)味等性狀影響較小。Hall等等研究發(fā)現，花序軸韌皮部的壞死導致漿果中水分和糖分不再積累，但花序軸韌皮部的壞死并不影響種子在果實(shí)中的發(fā)育。Chatelet等通過(guò)對體細胞突變進(jìn)行誘導，得到了4種不同于親本的花序表型，發(fā)現體細胞突變導致擬南芥成花基因AG、SEP和AGL13的同源因子VvMADS-box1、2和3在花發(fā)育過(guò)程中表達模式發(fā)生了轉化，而VvMADS-box基因的表達模式與相應的親本相似。

葡萄花序發(fā)育早期出現的表型變化主要跟葡萄重復分生組織(RRM)相關(guān)，變異品種花序發(fā)育期延長(cháng)，導致開(kāi)花延遲，從而影響果穗的發(fā)育和果實(shí)的成熟。佳麗釀(Carignan)RRM表現型的出現主要與VvTFL1A基因表達量的增高密切相關(guān)，歸其原因主要是VvTFL1A基因中的一個(gè)二級轉座子插入。Fernandez等通過(guò)轉錄組學(xué)及分子生物學(xué)的方法研究發(fā)現，將二級轉座子Hatvine1-rrm插入到VvT-FL1A基因的啟動(dòng)子，可以上調莖尖營(yíng)養及生殖器官的VvTFL1A等位基因的表達。

3.3成熟期變異

果實(shí)成熟是一個(gè)復雜的過(guò)程，涉及到許多高度協(xié)調的生理和生化變化，進(jìn)而影響果實(shí)的外觀(guān)。果實(shí)成熟包括果皮顏色的一系列變化，可溶性糖的積累、酸的減少、香氣化合物的增加。果實(shí)糖、酸的變化主要是一些調控基因的表達所引起的。目前對與成熟期相關(guān)的芽變品種和原有品種差異表達進(jìn)行分析，結果表明大多數差異基因與果實(shí)生長(cháng)發(fā)育的生物合成途徑有關(guān)。植物信號轉導途徑在果實(shí)成熟過(guò)程中有著(zhù)至關(guān)重要的作用。特別是ETH和ABA在調節果實(shí)發(fā)育中起到?jīng)Q定性作用。植物激素ETH和ABA促進(jìn)果實(shí)的成熟，而IAA抑制果實(shí)的成熟和著(zhù)色。

巨峰的芽變品種峰早較巨峰提前成熟30d，郭大龍等根據E-L系統對巨峰及峰早漿果不同發(fā)育時(shí)期的生理指標進(jìn)行測定，研究表明峰早中的花色素含量及果實(shí)軟化相關(guān)的半乳糖醛酸酶活性增長(cháng)速率均明顯高于巨峰并參與到果實(shí)成熟過(guò)程中;同時(shí)，Xi等研究巨峰及峰早成熟過(guò)程中代謝相關(guān)酶和活性氧(ROS)的變化，結果表明峰早果實(shí)中的活性氧水平總高于巨峰，活性氧參與并促進(jìn)果實(shí)的成熟。石艷艷通過(guò)MSAP分子標記技術(shù)，對甲基化率進(jìn)行分析，結果表明芽變的甲基化率低于親本，果實(shí)提早成熟主要是某些基因發(fā)生了脫甲基化。Guo等對巨峰及峰早果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行轉錄組測序，發(fā)現有3個(gè)基因表達量差異較為顯著(zhù)，其中與活性氧相關(guān)基因VIT_214s0030g00950的表達量主要在巨峰中表達較高，但在始熟期時(shí)低于峰早。Xu等在對夏黑及其早熟芽變分析中發(fā)現夏黑中SNP位點(diǎn)突變主要集中在其18號染色體，在其芽變中SNP位點(diǎn)突變主要集中在其17號染色體。

3.4果型變異

果樹(shù)中花授粉受精后果實(shí)開(kāi)始生長(cháng)，這是一種較為特別的特化結構。果實(shí)的生長(cháng)發(fā)育過(guò)程可分為兩個(gè)階段，即細胞分裂期與細胞膨大期。在果實(shí)發(fā)育階段，成熟后果實(shí)的形狀與大小主要根據細胞的數目與大小所決定。目前在對葡萄的研究中，果型主要依靠雜交后代與實(shí)生后代進(jìn)行選育并研究，但一些葡萄品種中果型發(fā)生了變異。

利用無(wú)核白芽變選育出了長(cháng)粒無(wú)核白、大粒無(wú)核白等芽變品種，通過(guò)對無(wú)核白及其芽變對比分析發(fā)現芽變品種中白藜蘆醇含量較高，而總酚含量較低。瘦肉果突變(flb)最早于1996年在白玉霓(Un-giBlanc)中發(fā)現，后來(lái)被鑒定為遺傳性嵌合體，在對葡萄果實(shí)發(fā)育及大小研究中，為一種優(yōu)良的實(shí)驗材料。其主要是由于親本植株在花期前子房開(kāi)始皺縮，發(fā)育出特殊的中果皮，致使產(chǎn)生的后代坐果異常，產(chǎn)生瘦肉果突變。

瘦肉果突變?yōu)楣庑螒B(tài)的分子調控機制提供了有利的基因型。通過(guò)親本與瘦肉果突變體果實(shí)成熟期對比發(fā)現，與親本相比，瘦肉果突變中液泡較多，細胞特異性受損導致中果皮發(fā)育不全。同時(shí)在瘦肉果突變及親本的基因組中發(fā)現，轉錄因子VvMADS9表達量較高，而在親本中并不表達，因此漿果形態(tài)的變異可能與轉錄因子VvMADS9的表達相關(guān)。

3.5無(wú)核變異

無(wú)核是鮮食葡萄最有價(jià)值的品質(zhì)特征之一，世界上對無(wú)核葡萄品種的需求也不斷增長(cháng)。目前已有一些品種發(fā)生了從有核到無(wú)核的突變，如Emper-or、GoHaskellsNo.45、Chasselas、Concord、Catawba、Mustat、Hamburg、Tokay、RedMuscadel和Liatiko等。無(wú)核突變體與親本相比果實(shí)質(zhì)量下降，對親本及無(wú)核芽變測序發(fā)現一些差異基因主要富集在花粉和胚珠發(fā)育途徑，在基因組上存在一些SNP位點(diǎn)的變異及Indel。在對差異基因分析時(shí)發(fā)現，B3轉錄因子基因家族在生長(cháng)和發(fā)育中發(fā)揮著(zhù)特定的作用，一些基因在無(wú)核突變體及其親本中差異表達。同時(shí)在VvAGL11基因區域鑒定出多個(gè)SNP位點(diǎn)變異，對VvAGL11進(jìn)行驗證發(fā)現在種子發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期，無(wú)核突變體中VvAGL11基因未表達，表明VvAGL11基因為無(wú)核主要的候選基因。

3.6植株結構變異

在極少數情況下，芽變可以改變植株的表型結構。PinotMeunier是黑比諾的芽變品種，其特點(diǎn)是葉子和莖上密布著(zhù)毛狀體，卷須轉變?yōu)榛ㄐ?。有時(shí)在PinotMeunier上會(huì )出現缺乏毛狀表型的葉扇區，這表明它是具有突變體L1的周緣嵌合體。事實(shí)上，從L1或L2層再生的植株表明L1衍生的植株是有毛的，而L2衍生的植株是無(wú)毛的。同時(shí)發(fā)現L1層的變異植株節間較短，具有矮化作用。利用赤霉素(GA)對矮化植株進(jìn)行處理發(fā)現其并不是赤霉素(GA)生物合成突變體。該突變是由VvGAI高度保守的DELLA域中的非同義SNP引起的，該域編碼GA關(guān)鍵響應蛋白的成員。

3.7倍性變異

葡萄二倍體自然突變?yōu)槎啾扼w途徑主要有體細胞融合、體細胞加倍和配子加倍三種。目前突變?yōu)槿扼w的較少，主要的突變類(lèi)型為二倍體突變?yōu)樗谋扼w。選擇四倍體的優(yōu)良芽變是改良葡萄品種的重要途徑之一。異常的環(huán)境更易誘導突變，自然突變是自然發(fā)生的，不受人為控制。通過(guò)自然芽變篩選培育葡萄多倍體新品種，速度緩慢，隨機性大。

四、展望

芽變選育因簡(jiǎn)便、實(shí)用性等優(yōu)勢特點(diǎn)，一直是果樹(shù)品種選育的重要途徑。芽變品種在提供新的表型的同時(shí)，還保留了原有親本的理想性狀，這也是很多栽培品種源自于芽變的原因。目前果樹(shù)上存在很多的芽變品種，而葡萄通過(guò)芽變選育的品種多達50個(gè)。但是目前依然通過(guò)形態(tài)學(xué)及多種DNA分子標記法對芽變進(jìn)行鑒定。是否有一些特定的引物對芽變品種進(jìn)行區分鑒定，目前尚未可知。隨著(zhù)高通量測序的發(fā)展，相信這一問(wèn)題可以得到很好地解決。目前存在著(zhù)多種多樣的芽變品種，不同的基因參與到不同的調控中。通過(guò)對葡萄芽變及其親本的研究，已經(jīng)發(fā)現一些基因在芽變表型的調控中起著(zhù)關(guān)鍵作用，如ERF相關(guān)基因可能引起夏黑早熟芽變的成熟期提前、VvAGL11基因為葡萄無(wú)核突變體關(guān)鍵候選基因。但這些基因在芽變中的作用機制仍不明確。

未來(lái)隨著(zhù)技術(shù)的發(fā)展，對芽變的機制研究方向主要是：(1)如何區分芽變及其親本；(2)對芽變及其親本甲基化、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、結構變異位點(diǎn)(SV)等的研究;(3)具體性狀的芽變機制;(4)如何將研究結果運用到育種上，定向培育出優(yōu)良的芽變品種。