來(lái)源 | 中外葡萄與葡萄酒
摘 要: 葡萄霜霉病是嚴重危害葡萄的世界性病害，抗霜霉病育種是解決歐洲葡萄抗病性差的有效途徑。 中國蘊藏著(zhù)豐富的野生葡萄種質(zhì)資源，鑒定這些資源的抗病性是抗病育種的前提。本文采用田間自然鑒定法，對中國野生葡萄10個(gè)種29個(gè)株系以及17個(gè)歐洲葡萄品種、9個(gè)歐美雜交品種共55份材料進(jìn)行抗霜霉病鑒 定，研究不同種質(zhì)資源的抗病性;進(jìn)一步在人工接種霜霉菌后，對抗病毛葡萄株系丹鳳-2及感病品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’進(jìn)行霜霉菌的侵染過(guò)程觀(guān)察，比較抗病與感病材料中菌絲生長(cháng)差異;在人工接種 霜霉菌條件下，對中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和感病品種‘黑比諾’‘白玉霓’的抗病相關(guān)基因表達量進(jìn)行分析。結果表明:中國野生葡萄、歐洲葡萄、美洲葡萄對霜霉病表現出抗病性差異，其中中國野生葡萄商南-1、湖南-1、商南-2、南鄭-1、白水-40、渭南-3、安林-2、安林-3以及歐美雜種‘瑞比爾’‘高妻’ 與砧木材料‘SO4’對霜霉病有較高的抗性，這些材料具有強的抗霜霉菌入侵能力，以及抗病相關(guān)基因的上調表達。因此，本研究中中國野生葡萄中對霜霉病表現抗病的株系是今后抗病育種可以利用的親本材料。
葡萄是一種廣泛栽培的果樹(shù)，在世界和我國園藝作物中都有很高的經(jīng)濟價(jià)值。據世界糧農組織(FAO) 數據顯示，2019年全球葡萄栽培面積達到692.6萬(wàn) hm2， 總產(chǎn)量達到7713.9萬(wàn) t。其中，我國葡萄面積74.6萬(wàn)hm2， 居世界第二位;葡萄產(chǎn)量達1437.2萬(wàn) t，居世界第一位。 葡萄生產(chǎn)中的主栽品種以歐洲葡萄為主，品質(zhì)好，風(fēng)味佳，用途廣泛，但易感霜霉菌、白粉菌等真菌病害。 病害發(fā)生時(shí)，以化學(xué)方法噴藥為主，這不僅增加生產(chǎn)成本、造成環(huán)境污染，還會(huì )導致殺菌劑殘留，降低葡萄品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失。從長(cháng)遠看，進(jìn)行抗性育種是解決歐洲葡萄品種抗病性差的有效途徑。葡萄抗病育種的前提是擁有抗病的種質(zhì)資源，中國作為葡萄屬植物的重要起源中心之一，擁有豐富的野生葡萄種質(zhì)資源，對霜霉病表現出極好的抗性。因此，對包括中國野生葡萄在內的種質(zhì)資源進(jìn)行抗霜霉病的田間自然鑒定，篩選抗病種質(zhì)資源，對于抗霜霉病育種具有重要的科學(xué)意義。霜霉病是葡萄最具破壞性的真菌病害之一，是由一 種來(lái)自北美野生葡萄上的霜霉菌(Plasmopara viticola) 引起，后來(lái)通過(guò)砧木、接穗等途徑在歐洲各主產(chǎn)區傳播爆發(fā)，對歐洲葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失。我國由于早期缺乏相應的檢驗檢疫措施導致霜霉病進(jìn)入并大規模發(fā)病。葡萄霜霉菌主要侵染葉片，在環(huán)境條件適宜時(shí)，病菌在一個(gè)生長(cháng)季內連續繁殖多代，導致病情呈暴發(fā)式發(fā)展，使樹(shù)體光合性能降低，光合產(chǎn)物合成受阻， 從而影響葡萄產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)。在田間自然條件下，根據發(fā)病率調查葡萄種質(zhì)資源發(fā)病情況。按照感病指數統計，將葡萄種質(zhì)與株系的抗病性分成5級。對中國野生葡萄10個(gè)種29個(gè)株系以及17 個(gè)歐洲品種、9個(gè)歐美雜種進(jìn)行霜霉病抗病性鑒定，篩選抗霜霉病的種質(zhì)資源。同時(shí)，采用苯胺藍染色法，結合熒光顯微鏡技術(shù)對霜霉菌在抗病株系和感病品種中的侵染過(guò)程進(jìn)行觀(guān)察，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)對葡萄霜霉菌抗病相關(guān)基因的表達進(jìn)行分析，進(jìn)一步證實(shí)葡萄種質(zhì)資源的抗病表現，以期為葡萄抗霜霉病育種提供依據。
一、材料與方法
1.1 試驗材料
2019—2020年在霜霉病流行后期的9月進(jìn)行調查。田間自然抗病鑒定材料為中國野生葡萄10個(gè)種29個(gè)株系以及17個(gè)歐洲品種、9個(gè)美洲品種共計55份。田間試驗于西北農林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃進(jìn)行，室內分析研究在國家旱區作物逆境生物學(xué)實(shí)驗室與農業(yè)部西北地區園藝 作物生物與種質(zhì)創(chuàng )制重點(diǎn)實(shí)驗室進(jìn)行。
1.2 葡萄霜霉病田間抗病性鑒定
按照葉片感病面積占整個(gè)葉片面積的百分比，將葡萄抗霜霉病分為0~7共8個(gè)級別進(jìn)行調查統計，然后用加權的方法統計出植株發(fā)病的感病指數。計算公式如下:感病指數=Σ(病極值×該級發(fā)病葉數)/(調查總葉數 ×最高病極值)×100%根據感病的嚴重程度把材料分成5級。具體是:0 為免疫或未發(fā)病;0.1~5.0為高抗;5.1~25.0為抗病; 25.1~50.0為感病;50.1~100為高感。
1.3 葡萄葉片苯胺藍染色過(guò)程
苯胺藍染色液制備方法參考李卓方法。取0.05 g苯 胺藍溶于100 mL磷酸二氫鉀(0.067 Mol)中制備0.05%苯胺藍染色液。將霜霉菌孢子囊懸浮液(2 ×104 cfu/mL) 均勻噴灑在葡萄葉背并套袋。分別于接種后0、12、36、60、84 h取樣浸泡于0.05%苯胺藍染色液中過(guò)夜。將葉背面朝上放在載玻片上，用藍紫光觀(guān)察菌絲生長(cháng)情況。
1.4 熒光定量PCR分析抗病基因的表達
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物設計參照Cheng等列于 (表1)，對‘丹鳳-2’‘塘尾’‘白玉霓’‘黑比諾’ 人工接種霜霉菌處理，于接種后0、12、24、48、72、96 h分別采樣提取RNA。提取方法參照Hipure Plant RNA Mini Kit試劑盒(Magen R4151-02)的說(shuō)明書(shū)。反轉錄合成cDNA的方法參照SumOnetube RT Mixture III(gDNA removal)試劑盒(夏末科技 SUM7806)的說(shuō)明書(shū)。稀釋后的cDNA作為qRT-PCR的模板。以葡萄Actin為內參 基因。實(shí)驗方法參考Shi進(jìn)行3 次生物學(xué)重復，每處理 3次技術(shù)重復。
1.5 數據統計與分析
用Excel軟件對大田統計數據進(jìn)行整理分析，用 Origin 8.0繪制實(shí)時(shí)熒光定量PCR數據分析圖。基因相對表達量的顯著(zhù)性分析通過(guò)SPSS 25.0單因素方差分析的LSD法分析比較檢驗(P<0.01)差異結果。
二、結果與分析
2.1 葡萄霜霉病田間自然抗病性鑒定
2.1.1 中國野生葡萄霜霉病田間自然抗病性鑒定
利用田間自然抗病鑒定的方法對中國野生葡萄10個(gè)種29個(gè)株系進(jìn)行抗霜霉病鑒定(表2)。其中，中國野生種華東葡萄商南-1、湖南-1、商南-2，毛葡萄南鄭-1，復 葉葡萄眉縣-6、白水-40、渭南-3，癭薁葡萄安林-2、安林-3對霜霉病有較高的抗性;復葉葡萄留壩-11、留壩-9 為易感霜霉病株系。
2.1.2 歐洲種與歐美雜種葡萄霜霉病田間抗病性鑒定
利用田間自然抗病鑒定方法對17個(gè)歐洲種、9個(gè)歐美雜種進(jìn)行抗霜霉病鑒定。其中歐美雜種‘瑞比爾’‘SO4’‘高妻’對霜霉病有較高的抗性;歐洲品種 ‘白詩(shī)南’‘法國藍’‘黑玫瑰’易感霜霉病(表3)。
2.2 田間人工接種霜霉菌的侵染菌絲觀(guān)察
利用人工接種的方法對抗病株系丹鳳-2，感病品種 ‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’進(jìn)行人工接種霜霉菌處理，觀(guān)察侵染過(guò)程。發(fā)現丹鳳-2接種霜霉菌84h后可觀(guān)察到初生菌絲;‘白玉霓’接種12h后有初生菌絲，36h后有分支的長(cháng)菌絲，84h后出現聚集成團的長(cháng)菌絲; ‘黑比諾’接種12h后可觀(guān)察到長(cháng)菌絲，36h后可觀(guān)察 到有分支的長(cháng)菌絲，60h后出現聚集成團的長(cháng)菌絲，84h 后出現壞死;‘法國藍’接種12h后可觀(guān)察到長(cháng)菌絲，36h后可觀(guān)察到有分支的長(cháng)菌絲，84h后出現聚集成團的長(cháng)菌絲。霜霉菌侵入‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’ 后，菌絲的生長(cháng)和發(fā)育明顯快于丹鳳-2。
2.3 部分種質(zhì)抗病相關(guān)基因表達水平
通過(guò)病原菌侵染觀(guān)察，對不同種質(zhì)的入侵能力不同，這可能與組織結構有關(guān)，也可能與抗病基因表達后促進(jìn)抵抗病原菌入侵的物質(zhì)累積有關(guān)。對兩個(gè)中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和兩個(gè)易感品種‘黑比諾’‘白玉霓’接種霜霉菌后進(jìn)行qRT-PCR分析，通過(guò)檢測抗病相關(guān)基因的表達結果顯示，抗病基因在抗病品種和易感品種中的表達有顯著(zhù)差異，中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2的葉片接種霜霉菌12h后苯丙氨酸解氨酶基因 PAL表達量顯著(zhù)提高，芪合酶基因STS接種霜霉菌96h后表達量顯著(zhù)高于易感品種‘黑比諾’‘白玉霓’;中國 野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾的葉片接種霜霉菌后病程 相關(guān)基因非表達子NPR1基因均出現表達量遞減的情況;中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和兩個(gè)易病品種‘黑 比諾’‘白玉霓’的葉片在人工接種霜霉菌后，類(lèi)甜蛋 白基因TLP 均出現表達量遞增的趨勢。
三、討論與結論
中國蘊藏著(zhù)豐富的野生葡萄種質(zhì)資源，鑒定這些資源的抗病性是抗病育種的前提。賀普超等提出中國野生葡萄抗霜霉病的鑒定方法并對中國野生葡萄21個(gè)種 67個(gè)株系和部分歐洲品種進(jìn)行抗病性鑒定認為，華東葡萄、燕山葡萄、瘤枝葡萄、復葉葡萄、秋葡萄對抗霜霉病具有良好的抗性。本次田間自然抗病性鑒定也發(fā)現，中國野生葡萄華東葡萄商南-1、湖南-1、商南-2， 復葉葡萄眉縣-6、白水-40，秋葡萄白河-22、平利-7等株系對霜霉病都有較高的抗性。Blaich利用人工接種方法對45個(gè)歐洲種、32個(gè)美洲種及26個(gè)歐美雜交子代進(jìn)行接種霜霉菌處理，發(fā)現接種后歐洲種最容易表現癥狀，其次為歐美雜交子代，最不容易出現癥狀的為美洲種。 Bower以歐洲種為試材，利用田間自然抗病性鑒定法對29個(gè)歐洲種進(jìn)行鑒定后認為，不同品種對霜霉病的抗 性也不同。Burruano利用人工接種霜霉菌的方法對不 同葡萄品種接種后發(fā)現，霜霉菌在不同品種中的生長(cháng)速度不同，其中霜霉菌在歐洲品種中生長(cháng)最快。本試驗田間自然抗病性鑒定也發(fā)現，中國野生種、歐美雜交子代對霜霉病的抗性普遍高于歐洲品種。利用苯胺藍染色的方法發(fā)現霜霉菌侵入感病的歐洲品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’后，其菌絲的生長(cháng)和發(fā)育明顯快于侵入中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2;Trouvelot以18個(gè)歐洲種、11個(gè)美洲種為試材，人工接種霜霉菌的侵染過(guò)程發(fā)現，在接種霜霉菌5d后，18個(gè)歐洲種中有17個(gè)出現壞死性病斑，而11個(gè)美洲種均沒(méi)有出現壞死性病斑，這與本試驗結果類(lèi)似。萬(wàn)怡震等對中國野生葡萄17個(gè)種的 67個(gè)株系在自然條件下進(jìn)行抗病性鑒定，發(fā)現多個(gè)株系對霜霉病抗性鑒定結果與本鑒定結果存在一定的差異， 這可能與年份、樹(shù)齡及病原菌積累有關(guān)，這為進(jìn)一步的研究提供了方向。Javier以21個(gè)美洲品種和60個(gè)歐洲品種為試材，利用離體接種鑒定的方法進(jìn)行霜霉病抗性評價(jià)后認為，歐洲種對霜霉病的抗性普遍低于美洲種。 Toffolatti以美洲種、歐洲種以及歐美雜種為試材，人工接種霜霉菌后從組織結構抗性和生理生化抗性進(jìn)行分析后認為，美洲葡萄對霜霉菌較高的抗性與葉片結構和抗病基因的表達有關(guān)。組織結構是植物抵抗真菌病害的重要器官。在棉花、蠶豆、棗樹(shù)等植物中都發(fā)現物理防御機制是植物抵御真菌侵染的重要方式。早期Marois以‘無(wú)核白’為試材利用氯仿溶劑除去葡萄表皮蠟質(zhì)層后發(fā)現，‘無(wú)核白’ 對灰霉病的抗性顯著(zhù)降低;Selim以‘無(wú)核白’和‘雷司令’為試材利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析后認為，葡萄葉片下表皮中的殼聚糖合成基因是響應霜霉菌侵染的 重要基因。Lemai?tre-Guillier通過(guò)葡萄蛋白質(zhì)組學(xué)分析認為，角質(zhì)層是葡萄抵御霜霉菌侵染的重要屏障。有學(xué)者采用轉錄和代謝組學(xué)分析認為，葡萄上表皮中的殼聚糖是抵御葡萄灰霉菌的重要物質(zhì);韓蕊通過(guò)對不同抗性葡萄葉片與黑痘菌互作的超微結構觀(guān)察認為，葡萄對黑痘病的抗性與上表皮厚度有關(guān)。林玲認為，毛葡萄葉背絨毛為阻礙霜霉菌的侵染發(fā)揮了重要作用。本次通過(guò)對人工接菌后的中國野生毛葡萄抗病株系丹鳳-2，感病品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’侵染過(guò)程的觀(guān)察，認為丹鳳-2葉背絨毛是其抵抗霜霉菌侵染的屏障。葡萄生理生化指標抗性是其抵御真菌侵染的重要途徑。苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達量和活性的提高能促進(jìn)木質(zhì)素及酚類(lèi)等次生物質(zhì)的合成，是植物抵抗真菌病害的關(guān)鍵基因。本次實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現，中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2在接種霜霉菌12 h后苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達量顯著(zhù)高于易感品種‘黑比諾’與‘白玉霓’;Vannozzi通過(guò)基因組學(xué)分析認為，芪類(lèi)物質(zhì)是 葡萄抵御霜霉菌侵染的重要植保素之一，Gamm以多個(gè)釀酒葡萄為試材，利用實(shí)時(shí)熒光定量分析技術(shù)發(fā)現多個(gè)抗病品種中的芪合酶基因STS在人工接種霜霉菌后會(huì )最先響應霜霉菌的誘導，本次實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現，丹鳳-2接種霜霉菌后芪合酶基因STS表達量顯著(zhù)高于易感品種‘黑比諾’與‘白玉霓’;TLP家族是病程相關(guān)蛋白家族之一，在植物中具有廣譜的抗真菌活性。通過(guò)抑制真菌酶活性，使真菌細胞膜透化，從而起到抵抗真菌侵染的作用。Kortekamp分析多個(gè)抗病品種和易感品種中的PR蛋白編碼基因和苯丙類(lèi)代謝相關(guān)基因的表達發(fā)現，抗病基因在抗病品種和易感品種中的表達有顯著(zhù) 差異，其中類(lèi)甜蛋白基因TLP在抗病品種和易感品種中均有顯著(zhù)表達。本試驗RT-PCR分析發(fā)現，類(lèi)甜蛋白基因TLP在抗病株系丹鳳-2接種霜霉菌后12h表達量顯著(zhù)提高;趙惠以3個(gè)抗病株系和3個(gè)感病株系為試材，利用實(shí)時(shí)熒光定量分析技術(shù)認為，TLP、NPR1在6個(gè)不同株系中響應霜霉菌侵染迅速，可能是葡萄調控霜霉病抗性的關(guān)鍵基 因，這與本次實(shí)時(shí)熒光定量分析結果不同，其原因可能與試材有關(guān)。綜上，中國野生葡萄、歐洲葡萄、歐美雜種葡萄對霜霉病表現出抗病性差異，其中中國野生葡萄商南-1、 湖南-1、商南-2、南鄭-1、白水-40、渭南-3、安林-2、 安林-3以及美洲品種‘瑞比爾’‘高妻’與砧木材料 ‘SO4’對霜霉病有較高的抗性，具有強的抗霜霉菌入侵以及抗病相關(guān)基因的上調表達能力。因此，中國野生葡萄抗霜霉病株系商南-1、湖南-1、商南-2、南鄭-1、白 水-40、渭南-3、安林-2與安林-3是今后抗病育種可以利用的親本材料與抗病種質(zhì)。
116次
相關(guān)關(guān)鍵詞
全國分公司
