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無核和香味是葡萄果實(shí)的重要品質(zhì)特性，也是深受消費(fèi)者歡迎的性狀。目前，市場(chǎng)上無核且具有香味的葡萄品種較缺乏，培育香味無核的新品種是當(dāng)前葡萄育種的重要目標(biāo)之一。作為無核葡萄育種最有效的方法，胚挽救技術(shù)可將雜交后代的無核率提高到82%，育種周期比常規(guī)雜交育種至少縮短5年，因此，該技術(shù)得到越來越多的應(yīng)用。迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究者通過胚挽救技術(shù)已經(jīng)培育出一批無核葡萄新品種。然而，胚挽救的成功受許多因素的影響，包括親本基因型、取樣時(shí)期、培養(yǎng)基以及花前施用激素等，其中親本基因型占主導(dǎo)地位。敗育時(shí)胚發(fā)育程度較高的品種、胚較大的品種更適合作胚挽救的母本，父本基因型對(duì)胚珠數(shù)量和取樣時(shí)間也會(huì)產(chǎn)生一定影響。

本研究以4個(gè)種子敗育型葡萄品種紅寶石無核（RS）、愛神玫瑰（AS）、火州紫玉（HZ）和無核翠寶（WH）為母本，分別與玫瑰香型葡萄品種巨玫瑰（JM）、愛神玫瑰、陽光玫瑰（SM）和玫瑰香（MH）雜交，通過胚挽救技術(shù)創(chuàng)制一批玫瑰香型無核葡萄新種質(zhì)，同時(shí)比較不同親本對(duì)胚挽救效果的影響，并利用無核基因分子標(biāo)記VviAGL11-KASP和玫瑰香型基因分子標(biāo)記VviDXS-KASP輔助選擇雜交后代，為進(jìn)一步選育玫瑰香型無核葡萄新品種奠定基礎(chǔ)。

試驗(yàn)于2023年在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地葡萄試驗(yàn)園和河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所進(jìn)行。用于雜交的7個(gè)親本均為10年生以上成齡樹，采用簡(jiǎn)易避雨栽培，株行距1.5m×3m，南北行向，高寬垂架式，T形整形，常規(guī)管理。供試親本特性如表1所示。

春季，父本植株花序約5%小花開放時(shí)，采集飽滿花穗，先剔除已開放的小花，然后在潔凈硫酸紙上剝離花冠，取出花藥，放在燈管下晾曬至花粉散出，過篩后收集到10mL離心管中，封口，并置于盛有無水CaCl2的密閉容器中，保存于4°C冰箱備用?；ㄇ?～4d，用指尖小心去除母本的花冠及雄蕊，避免傷到柱頭，用蒸餾水沖洗2遍花穗以達(dá)到保濕和去除殘留花粉的目的，去雄后即刻套袋。去雄后2～3d，當(dāng)柱頭上出現(xiàn)粘液時(shí)，于上午7:00—9:00進(jìn)行授粉，授粉完成即刻套袋，并標(biāo)識(shí)雜交組合和授粉日期。去雄授粉期間手及所有器具用75%酒精消毒，避免花粉污染。

4個(gè)母本品種RS、AS、HZ、WH取樣時(shí)期分別為花后61d、45d、50d、36d，其中HZ的取樣時(shí)期在轉(zhuǎn)色期。

幼果用流水沖洗干凈后，放入超凈工作臺(tái)中。先用75%酒精消毒30s，再用無菌水漂洗2～3次，然后用2%NaClO消毒20min，最后用無菌水漂洗2～3次。將消毒后的幼果放在無菌培養(yǎng)皿中剝?nèi)∨咧?，挑選長(zhǎng)度在2mm以上的胚珠接種于ER固體培養(yǎng)基，每瓶接種15個(gè)胚珠，在25±1℃的培養(yǎng)室內(nèi)暗培養(yǎng)。培養(yǎng)基的制作參照Zhu等的方法：采用容量為200mL培養(yǎng)瓶，每個(gè)瓶中加入40mL固體ER培養(yǎng)基，附加成分包括0.5g·L^-1水解酪蛋白、1.0mmol·L^-1絲氨酸、1.0mg·L^-1IAA、0.5 mg·L^-16-BA、0.5mg·L^-1GA3、60.0g·L^-1蔗糖和3.0g·L^-1活性炭、7.0g·L^-1瓊脂，pH為5.8，121℃高壓蒸汽滅菌25min。

胚珠在黑暗條件下培養(yǎng)8～9周后，超凈工作臺(tái)中切開胚珠，取出亮白色胚（圖1E）進(jìn)行胚萌發(fā)培養(yǎng)。胚萌發(fā)成苗培養(yǎng)基為固體WPM培養(yǎng)基（WPM+0.2mg·L^-16BA+0.1mg·L^-1IBA+20g·L^-1蔗糖+1g·L^-1活性炭+7g·L¹瓊脂），25±2℃進(jìn)行光照培養(yǎng)，使其萌發(fā)成苗。此期間，統(tǒng)計(jì)胚發(fā)育率、萌發(fā)率、成苗率。

當(dāng)試管苗長(zhǎng)至近瓶口時(shí)，進(jìn)行繼代培養(yǎng)（? MS+0.2mg·L^-1 IBA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1瓊脂），每月繼代一次。

采用試劑盒（ND26F，諾萊梅，北京）從親本及其雜種苗幼葉中提取基因組DNA，并保存于-80 ℃。根據(jù)徐炎等（2022）的方法使用引物VviAGL11-KASP-Fa/Fb/R進(jìn)行無核基因分子標(biāo)記檢測(cè)，對(duì)于無法準(zhǔn)確區(qū)分的樣品使用引物VviAGL11-400-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增后送生工生物工程（上海）公司測(cè)序。根據(jù)王勇等（2023）方法使用引物VviDXS-KASP-Fa/Fb/R進(jìn)行玫瑰香型性狀鑒定。

有關(guān)胚發(fā)育率、萌發(fā)率和成苗率的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行3次重復(fù)，使用IBM SPSS 23.0中ANOVA單因素方差分析，顯著性分析選用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（P<0.05）。

7個(gè)雜交組合共剝?nèi)∨咧?466個(gè)，發(fā)育胚935個(gè)，萌發(fā)胚607個(gè)，成苗316株，平均成苗率為5.78%。其中，組合RS×MH胚發(fā)育率最高，為26.96%；組合RS×SM的胚萌發(fā)率和成苗率最高，分別為17.42%和11.36%，上述2個(gè)組合的胚發(fā)育率、胚萌發(fā)率和成苗率之間差異不顯著。7個(gè)雜交組合中，胚發(fā)育率最低的是AS×JM，胚萌發(fā)率和成苗率最低的是WH×JM（表3）。

從表3中可以看出，RS×JM的胚發(fā)育率、萌發(fā)率、成苗率均顯著高于AS×JM和WH×JM，以JM為父本時(shí)，RS比AS和WH更適合作母本；當(dāng)以AS為父本時(shí)，以RS為母本雜交的胚挽救效率顯著高于以HZ為母本的雜交組合，RS比HZ更適合作母本與AS雜交。

在同以RS為母本的雜交組合中，RS×SM和RS×MH的胚挽救效率顯著高于其他2個(gè)雜交組合，4個(gè)雜交組合的成苗率均高于5%。因此，以RS為母本時(shí)，SM、MH、JM和AS均可為父本，且SM和MH比JM和AS更適合作父本。

2.4.1 無核分子標(biāo)記對(duì)雜交親本及后代的檢測(cè)

對(duì)雜交親本RS、AS、HZ和WH的檢測(cè)結(jié)果為基因型A:C，表現(xiàn)為無核；SM、JM和MH的檢測(cè)結(jié)果為基因型C:C，表現(xiàn)為有核（圖1A）。對(duì)雜交后代進(jìn)行VviAGL11-KASP檢測(cè)，結(jié)果顯示RS×AS后代117個(gè)植株中有53個(gè)基因型為A:C，21個(gè)基因型為A:A，表現(xiàn)為無核（圖1B），對(duì)無法準(zhǔn)確區(qū)分的3個(gè)植株，使用VviAGL11-400進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，結(jié)果顯示其中2個(gè)植株表現(xiàn)為無核（圖2），RS×AS雜交后代無核率為64.96%；RS×SM雜交后代75個(gè)植株中有21個(gè)基因型為A:C，2個(gè)基因型為A:A，表現(xiàn)為無核（圖1C），對(duì)無法準(zhǔn)確區(qū)分的17個(gè)植株，測(cè)序結(jié)果顯示均表現(xiàn)為無核（圖2），RS×SM雜交后代無核率為53.33%；RS×MH雜交后代58個(gè)植株中有37個(gè)基因型為A:C，5個(gè)基因型為A:A，表現(xiàn)為無核（圖1D），對(duì)無法準(zhǔn)確區(qū)分的2個(gè)植株，測(cè)序結(jié)果1個(gè)表現(xiàn)為無核（圖2），RS×MH雜交后代無核率為74.14%；RS×JM的28個(gè)雜交后代中，26個(gè)基因型為C:C，表現(xiàn)為有核（圖2E），對(duì)無法準(zhǔn)確區(qū)分的2個(gè)植株，測(cè)序結(jié)果1個(gè)表現(xiàn)為無核（圖2），RS×JM雜交后代無核率為3.57%；AS×JM的27個(gè)雜交后代中，2個(gè)基因型為A:C，表現(xiàn)為無核（圖1F），對(duì)無法準(zhǔn)確區(qū)分的5個(gè)植株，測(cè)序結(jié)果均表現(xiàn)為無核（圖2），AS×JM雜交后代無核率為25.93%；HZ×AS的10個(gè)雜交后代中，5個(gè)基因型為A:A，表現(xiàn)為無核（圖1G），對(duì)無法準(zhǔn)確區(qū)分的3個(gè)植株，測(cè)序結(jié)果均表現(xiàn)為無核（圖2），HZ×AS雜交后代無核率為80.00%；WH×JM的1個(gè)雜交后代檢測(cè)結(jié)果基因型為A:C，表現(xiàn)為無核（圖1H）。綜上，7個(gè)雜交組合的316個(gè)后代中檢測(cè)出176個(gè)無核植株，平均無核率為55.70%。

2.4.2 玫瑰香型分子標(biāo)記對(duì)雜交后代的檢測(cè)

對(duì)雜交親本W(wǎng)H、AS、SM、JM、MH的檢測(cè)結(jié)果為基因型G:T，表現(xiàn)為玫瑰香型；RS和HZ的檢測(cè)結(jié)果為基因型G:G，表現(xiàn)為無香型（圖3A）。對(duì)雜交后代進(jìn)行VviAGL11-KASP檢測(cè)，結(jié)果顯示，RS×AS后代117個(gè)植株中檢測(cè)出42個(gè)植株基因型為G:T，11個(gè)植株的基因型為T:T（圖3B），表現(xiàn)為玫瑰香型，RS×AS獲得玫瑰香型雜交后代的比率為45.30%；RS×SM雜交后代中，75個(gè)植株中有7個(gè)基因型為G:T，28個(gè)基因型為T:T（圖3C），表現(xiàn)為玫瑰香型，RS×SM獲得玫瑰香型雜交后代的比率為46.67%；RS×MH雜交后代58個(gè)植株中有39個(gè)基因型為G:T，12個(gè)基因型為T:T（圖3D），表現(xiàn)為玫瑰香型，RS×MH獲得玫瑰香型雜交后代的比率為87.93%；RS×JM雜交后代中，28個(gè)植株中有11個(gè)基因型為G:T，6個(gè)基因型為T:T（圖3E），表現(xiàn)為玫瑰香型，RS×JM獲得玫瑰香型雜交后代的比率為60.71%；AS×JM雜交后代27個(gè)植株中有3個(gè)基因型為G:T，23個(gè)基因型為T:T（圖3F），表現(xiàn)為玫瑰香型，AS×JM獲得玫瑰香型雜交后代的比率為96.30%；HZ×AS的10個(gè)雜交后代未檢測(cè)出玫瑰香型后代（圖3G）；WH×JM的1個(gè)雜交后代基因型為T:T（圖3H），表現(xiàn)為玫瑰香型。綜上，7個(gè)雜交組合的316個(gè)后代中檢測(cè)出183個(gè)玫瑰香型植株，獲得玫瑰香型后代的比率為57.91%。

經(jīng)檢測(cè)，組合RS×AS有36個(gè)雜交后代同時(shí)具有無核和玫瑰香型基因標(biāo)記，RS×MH有39個(gè)，RS×SM有27個(gè)，AS×JM有7個(gè)，WH×JM有1個(gè)。316個(gè)雜交后代中同時(shí)具有無核及玫瑰香型標(biāo)記的植株有110個(gè)，占比為34.81%。

合子胚的形成能力和發(fā)育進(jìn)程受親本基因型的嚴(yán)格控制，母本基因型顯著影響胚挽救效果。此外，胚挽救的效率還與母本成熟期有關(guān)，早熟品種胚發(fā)生敗育較早，發(fā)育程度低，不適宜用作胚挽救母本，晚熟品種胚挽救成功率較高。近年來，學(xué)者多以胚挽救的成苗率來評(píng)價(jià)種子敗育型品種的可挽救性，胚挽救成苗率低于5%的葡萄品種不適合作母本。本研究中，以晚熟品種RS為母本的4個(gè)雜交組合成苗率均高于5%，因此，RS比較適宜作胚挽救母本，與前人研究結(jié)果一致。以早熟品種AS和WH作母本的雜交組合成苗率低于5%，不適宜作胚挽救母本，晚熟品種HZ由于胚珠較小，可挽救性也很差。同以RS為母本的4個(gè)雜交組合由于父本不同，胚發(fā)育率、萌發(fā)率與成苗率也有顯著差異，表明父本基因型也會(huì)對(duì)胚挽救效果產(chǎn)生一定的影響，這可能是因?yàn)楦副緯?huì)通過影響胚的發(fā)育進(jìn)程而影響發(fā)育胚的數(shù)量，從而影響到胚挽救的效率。

無核性狀遺傳較為復(fù)雜，其規(guī)律尚未完全揭示。本研究選用VviAGL11-KASP對(duì)7個(gè)雜交組合后代進(jìn)行檢測(cè)。其中RS×AS后代無核率為64.96%，HZ×AS后代的無核率為80.00%，與Ramming的結(jié)果無核×無核后代無核率45%～85%相符合；而5個(gè)無核×有核雜交組合后代的無核率介于3.57%～100%。推測(cè)雜交后代無核率差異大的原因是3個(gè)組合RS×JMAS×JMWH×JM是二倍體與四倍體雜交，染色體不配對(duì)，存在雜交不親和問題導(dǎo)致后代樣本量較小，存在實(shí)驗(yàn)誤差。

研究表明，葡萄的玫瑰香氣與單萜類化合物的存在有關(guān)，主要包括香葉醇、里那醇、橙花醇、香茅醇、α-松油醇等。有研究者對(duì)鮮食葡萄果實(shí)單萜合成關(guān)鍵基因進(jìn)行eQTL定位及候選基因挖掘，共檢測(cè)到37個(gè)與單萜合成途徑基因表達(dá)相關(guān)的eQTL。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）是調(diào)節(jié)葡萄果實(shí)中單萜類物質(zhì)合成的主要調(diào)節(jié)因子。王勇等（2023）參照葡萄DXS位點(diǎn)信息合成KASP標(biāo)記引物序列，對(duì)27個(gè)品種資源果實(shí)萜類物質(zhì)調(diào)控基因DXS位點(diǎn)基因型進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記對(duì)葡萄香型物質(zhì)調(diào)控位點(diǎn)的基因型檢測(cè)具有較高準(zhǔn)確性。本研究中，AS×JM后代經(jīng)檢測(cè)玫瑰香型比率達(dá)96.30%，顯著高于以RS為母本的雜交組合，表明葡萄果實(shí)香味遺傳傾向趨向親本，雙親均具有玫瑰香味的雜交組合比單親具有玫瑰香味的雜交組合更易獲得玫瑰香味的后代。在以‘紅寶石無核’為母本的4個(gè)雜交組合中，RS×MH獲得玫瑰香型后代的比率顯著高于以JMAS和SM為父本的雜交組合。因此，同樣的母本條件下，選擇MH作父本更易獲得玫瑰香型后代。

綜上，親本基因型對(duì)胚挽救效果有顯著的影響，以母本影響更大。RS較適合作為無核葡萄胚挽救的母本，SM和MH比JM和AS更適合作父本與RS雜交。通過胚挽救共獲得316個(gè)新種質(zhì)，其中176個(gè)具有無核標(biāo)記，183個(gè)具有玫瑰香型標(biāo)記，同時(shí)具有無核和玫瑰香型標(biāo)記的有110個(gè)，占比為34.81%。選擇雙親均無核或具有玫瑰香味的雜交組合更易獲得玫瑰香型無核葡萄后代。